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     血管介入支架植入治療因具有創傷小、 恢復快和療效好等優勢， 近年來被廣泛應用于臨床。其不僅在以下肢動脈狹窄或閉塞、 腎動脈狹窄、腹主動脈瘤和醫源性假性動脈瘤等為代表的動脈疾病中已得到廣泛應用， 而且在以布加綜合征、靜脈畸形和靜脈血栓栓塞等為代表的靜脈疾病中也得到了廣泛應用［１ － ２］ 。但是， 隨著應用范圍愈加廣泛， 血管介入支架植入治療的缺點愈發明顯。在支架植入后， 血管內膜過度增生可引起血管支架內再狹窄， 其不僅成了限制介入治療發展的主要瓶頸， 還成了影響遠期療效的最主要因素。支架內再狹窄以往多表現在動脈血管內， 包括下肢動脈粥樣硬化閉塞支架術后再狹窄［３］ 、 冠心病合并 ２ 型糖尿病患者冠狀動脈支架股淺動脈支架術后再狹窄等［４ － ６］ ；且臨床已在細胞生物學水平、 分子生物學水平和基因水平等方面對其進行了大量研究。近年來， 隨著醫學技術的進步和人們生活方式的改變， 由于先、 后天靜脈結構和功能異常及其他因素而導致的靜脈閉塞或狹窄， 使得靜脈不暢、 回流、 靜脈壓力過高而引起的慢性靜脈疾病在成年人中的發病率日益增高［７ － ８］ ， 且隨著年齡的增長而不斷增高， 因此， 臨床增加了對靜脈內金屬支架的需求， 靜脈支架植入后再狹窄也引起了研究者的關注［９］ 。

      與鈷合金、 鈦合金和不銹鋼等傳統生物醫用金屬材料相比， 鎳鈦合金除了具有優異的形狀記憶效應、 良好的力學性能和生物相容性外， 還具有超彈性以及優異的耐磨損和耐腐蝕性能［１０ － １３］ ， 可在人體溫度下進行響應和改變， 因此已被廣泛應用于醫療器械領域， 如骨科、 口腔、 縫合線、心腦血管、 肝膽胸外等［１４ － １５］ 。隨著近年來血管疾病的增加， 鎳鈦合金逐步被應用于以血管支架為代表的微創植入器械［１６ － １７］ 。目前， 臨床上使用的鎳鈦合金外周血管支架以表面僅進行過拋光和耐腐蝕處理的裸支架為主， 表面多無抑制平滑肌細胞增生的藥物涂層， 這使得支架內再狹窄率高達２０％ ～ ６０％ ［１８ － １９］ 。為了預防支架內再狹窄， 確保臨床使用效果， 涂層及覆膜技術被應用在支架上。按表面性質， 當前的鎳鈦合金支架可分為裸支架， 金屬表面涂以紫杉、 肝素、 醇或者雷帕霉素等藥物的涂層支架［２０］ ， 以及表面覆蓋聚四氟乙烯、 聚酯、 滌綸等高分子薄膜材料的覆膜支架等［２１ － ２２］ 。相對而言， 表面經過涂層和覆膜處理的支架較裸支架制作工藝更加復雜， 雖然涂層藥物及覆膜被認為可能有助于降低支架內再狹窄的風險， 但對于在血管內較長期留置后是否能夠達到預期效果仍存在爭議。目前， 國內外對鎳鈦合金血管支架的研究分別集中在物理學性能［２３ － ２５］ 、 生物相容性［２６ － ２７］ 和耐腐蝕性［２８］ ， 而同時評價不同表面性質支架的生物相容性及支架植入后因早期血管彈性回縮、 血管重塑及內膜過度增生而引起的植入后支架內再狹窄的報道較少， 且有效利用動物實驗的組織病理學數據進行綜合評估的研究更為缺乏。基于此， 本研究對鎳鈦合金裸支架與覆膜支架動物植入研究后局部組織反應及血管內再狹窄情況進行了深入的比較， 以期為類似器械的評價方法研究提供線索。

１ 材料與方法

１. １  實驗動物

      ２０２０ 年 ７ 月， 選取健康實驗用普通白豬 ［ 由上海甲干生物科技有限公司提供， 動物生產許可證號：ＳＣＸＫ （ 滬） ２０１５ － ０００５］ ８ 頭， 雌雄不限， 體質量 ６０ ～ ７０ ｋｇ；隨機將其分為 Ａ 組 （４ 頭， 鎳鈦合金裸支架）  和 Ｂ  組  （ ４  頭，   鎳鈦合金覆膜支架）。實驗動物設施及管理均符合 ＧＢ ／ Ｔ １６８８６. ２ － ２０１１ 《醫療器械生物學評價  第 ２  部分： 動物福利要求。

１. ２ 主要試劑及儀器

      組織染色分化液、 醇溶性伊紅染液、 組織染色藍化液  （ Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ，  美國）；  ＥＸＡＫＴ ３００ ＣＰ ／ ４００ ＣＳ 硬組織切磨系統  （ ＥＸＫＴ  Ａｐｐａｒａｔｅ? ｂａｕ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ. ＫＧ，  德國）；  ＯＬＹＭＰＵＳ  ＶＳ２００ 全玻片掃描系統  （ Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 公司，  日本）。

１. 3  支架植入

      實驗動物術前應適應 １ 周 （ 飼養環境及喂養條件）， 確認其進食、 體溫、 排泄及精神狀態無異常后， 進行局部誘導麻醉， 待麻醉顯效后行氣管插管機械通氣， 連接麻醉機， 使用氧氣和異氟烷的混合氣體維持麻醉狀態，   在彩色多普勒超聲引導下行左側股靜脈穿刺，  并植入血管穿刺鞘，  在動物下腔靜脈處植入鎳鈦合金支架 （ 予以每頭豬植入 １ 枚支架）；植入后再進行造影， 觀察支架植入后支架形態及血管管腔暢通情況。

１. ４ 組織病理形態學觀察

      支架植入后 ４ 周， 取出含鎳鈦合金的支架段血管， 經固定、 脫水、 滲透、 包埋、  硬組織切片以及 ＨＥ 染色， 染色完成后進行全玻片掃描系統掃描，  觀察樣本完整組織情況，  并選用 ＯｌｙＶＩＡ 切片掃描儀閱讀軟件進行圖像分析；結合組織學劃分內彈力膜以內為血管內膜， 內外彈力膜之間為中膜，  結合Ｓｃｈｗａｒｔｚ 等［２９］ 和Ｃａｒｔｅｒ 等［３０］所述的方法，測定支架段血管切片的彈力膜面積、 管腔面積、新生內膜面積； 計算支架中段區域的血管重塑值（ 外彈力板圍繞面積／ 近段參考的外彈力板圍繞面積），近段和遠段區域參考的血管重塑值（內彈力板參考直徑／支架中段的內彈力板直徑），以及狹窄面積百分比（１－管腔面積／內彈力膜面積×１００％）；每個實驗血管的觀察指標均取遠、近、中３ 段測量的平均值；以內彈力板完整性、內膜和中膜的損傷情況來評估血管損傷情況， 以內皮細胞包繞管腔周徑的大小來評估血管內皮化程度，按照ＧＢ／Ｔ １６８８６. ６－２０１５《醫療器械生物學評價第 ６ 部分：植入后局部反應試驗》中半定量評價系統評價局部組織生物學反應。

１. ５ 統計學處理

      采用 ＳＰＳＳ１７. ０ 統計軟件進行數據分析，所得定量實驗數據以ｘ ±ｓ表示，兩組間比較采用獨立樣本 ｔ 檢驗， Ｐ ＜ ０.０５為差異有統計學意義。

      血管損傷 （ 表 １ 及圖 １）：植入后 ４ 周， Ａ 組（ 圖 １ｃ） 血管結構完整， 血管內膜連續， 管壁厚度均勻， 未見明顯損傷， 內外彈力板完整清晰； Ｂ 組（ 圖 １ｉ） 部分動物血管壁結構出現局部內彈力板斷裂， 彈力板不平整， 部分彈力板呈波浪狀排列， 中膜受壓， 彈力板間隙明顯增大， 局部內膜出現剝落， 血管損傷記分高于 Ａ 組 （ Ｐ ＞ ０. ０５）。

      內皮細胞包繞管腔周徑 （ 表 １ 及圖 １ ）：植入后 ４ 周， Ａ 組 （ 圖 １ｄ） 與 Ｂ 組 （ 圖 １ｊ） 血管管腔周圍均可見內皮細胞包繞， Ａ  組較  Ｂ  組血管內皮化稍高 （ Ｐ ＞ ０. ０５）。

      血管纖維化 （ 表 １ 及圖 １ ）：植入后 ４ 周， Ａ 組 （ 圖 １ｅ， ｆ） 動物支架均未出現明顯纖維化；Ｂ 組 （ 圖 １ｋ， ｌ）  部分動物支架出現纖維化， 記分高于 Ａ 組 （ Ｐ ＞ ０. ０５）， 且在新形成較厚的纖維囊壁上可見少量炎性細胞。

２. ３ 支架植入后局部組織反應結果

      植入后４周，Ａ組（圖２ａ，ｂ，ｃ）支架／組織界面與新生內膜內可見極少量淋巴細胞、嗜酸性粒細胞和巨噬細胞；Ｂ 組（圖 ２ｄ，ｅ） 支架／組織界面與新生內膜內可見極少量淋巴細胞、嗜酸性粒細胞和巨噬細胞， 局部新生內膜內可見以淋巴細胞和嗜酸性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤（圖２ｆ）。

３ 討論

      隨著人們生活方式的改變和人口老齡化趨勢的加劇， 以心血管和外周動脈疾病為代表的血管類疾病的發病率逐年升高， 這促進了以血管支架植入為代表的介入治療技術的發展。隨著支架介入治療的推廣， 接受介入治療的患者人數日益增多。然而， 每年仍有相當數量的支架植入后患者再次出現血管阻塞， 需再次行血運重建， 因此，植入后的支架內再狹窄問題逐漸成了限制介入治療發展的主要瓶頸［３１］ 。有研究跟蹤支架植入后的患者發現， 早期傳統的金屬裸支架植入后狹窄率通常為１５％ ～ ３２％ ， 中遠期則可高達 ３８％ ～ ４１％ ［３２］ 。另有研究指出， 有糖尿病背景或在血管分支處行支架植入的患者， 再狹窄率最高可達 ６０％ ［３３］ 。

      當前， 臨床普遍認為， 支架植入后血管內再狹窄的原因主要包含以下 ４ 個。（１） 血管內膜的過度增殖在支架再狹窄過程中起關鍵作用， 有研究指出，  在植入支架的 Ｂｅａｇｌｅ  犬的髂外動脈內［３２］和植入球囊的兔髂動脈內［３４］ ， 術后血管組織中可見以排列紊亂的血管平滑肌細胞及細胞外基質為主要成分的新生內膜， 且血管平滑肌細胞的增殖和遷移在血管再狹窄過程中起關鍵作用［３５］ ， 平滑肌細胞的增殖在 ４８ ｈ 內可由正常情況下的 １％ 增加至 ２０％ ， 內膜平滑肌細胞的數量在 ２ 周時達到最大值， 其中約 ３０％ 的中膜平滑肌細胞是由中膜遷移至內膜， 因此， 平滑肌細胞的遷移會直接導致新生內膜的增殖［３６－ ３７］。新生內膜的增殖以及厚度在第４周內達到峰值，且在已有內皮覆蓋的區域發生增殖的平滑肌細胞的數量在第４周恢復至基線水平［３３］。因此，本研究以４周作為觀察時間點來研究支架內再狹窄情況，且以上結果均與本研究中覆膜支架組局部動物靶血管出現內膜增生的情況一致。（２） 作為一種異物， 支架對機體血管管壁存在著持續的機械力作用， 甚至是損傷的風險， 從而激活中性粒細胞、 淋巴細胞和多核巨細胞等多種炎癥細胞， 導致炎癥細胞靶向血管浸潤， 進而引起機體局部炎癥反應［３８ － ３９］ 。而血管內皮損傷引起的局部炎癥反應則是支架再狹窄的一個重要因素。有研究指出， 在植入支架的兔子的髂動脈中， 內膜增生的厚度與單核細胞的聚集有關， 炎癥細胞的聚集在支架植入后的早期可達峰值且其程度與內膜增生相關［３４］ 。在植入支架的豬冠狀動脈中， 支架周圍炎癥細胞的浸潤程度與內膜增生的厚度和管腔狹窄率均存在一定的關聯［４０］ ， 與本研究中覆膜支架組出現的局部炎癥反應觀察結果一致。（３） 血管重塑分為擴張型重塑和收縮型重塑， 其中， 收縮型重塑易使血管狹窄加重， 血管損傷后新生內膜過度增生時， 血管即會出現再狹窄。而血管平滑肌細胞的增殖與凋亡是維持血管壁細胞數量相對恒定的一對基本因素， 是血管重塑的細胞學基礎［４１］ 。本研究中， 裸支架組血管新生內膜發生重塑， 厚度有所降低， 這與鎂合金植入犬的髂外動脈 ６ 個月支架完全降解后的血管重塑結果一致［３２］ 。而覆膜支架組血管出現收縮性重塑現象， 最終出現了血管內再狹窄。（４） 血管內皮細胞的損傷會誘導以炎癥因子分泌和單核細胞黏附為特征的炎癥反應， 反之， 炎癥反應又會影響內皮細胞的正常功能， 進而導致支架內再狹窄的發生， 本研究中的覆膜支架組損傷記分高于裸支架組， 與血管出現的炎癥反應相結合， 也證實了這一觀點。目前， 臨床上用來預防支架內再狹窄而使用的金屬支架，   其機制主要是通過支架自身的支撐作用，  有效阻止術后早期血管的彈性回縮，擴大管腔， 并在一定程度上抑制病理學血管重塑而導致的血管管腔收縮變窄， 但由于支架并不能阻止內膜的增生， 若內膜過度增生致使血管腔縮小超過支架造成血管腔擴大的補償， 則會導致再狹窄的發生［４２］ 。常規的金屬材料彈性通常為 ０. ５％ 以下， 而鎳鈦合金可達 ８％ ［４３］ ， 在介入醫療領域， 超過 ８０％ 的產品利用的是鎳鈦合金本身的超彈性， 能夠自行恢復到支架的開始形狀，  將靶病變血管撐開。

      在臨床應用中，   鎳鈦合金因具有獨特的形狀記憶特性， 可控制合金的相變溫度在體溫附近 （３６ ℃ ） 或者略高于體溫， 使其更好地恢復預定形狀并固定在原位， 操作簡單， 預后效果好［４４ － ４５］ 。本研究中，  覆膜支架組損傷后的血管結構破壞嚴重， 有炎癥細胞浸潤， 具有新生內膜，  厚度不均，  有炎癥細胞浸潤， 平滑肌細胞排列紊亂， 彈力纖維板不平整， 且板間隙增大明顯， 部分呈波浪狀排列， 這與植入球囊損傷后大鼠頸動脈組織表現結果一致［４６］ 。鎳鈦合金支架可抑制移植靜脈內膜增生， 減輕移植靜脈管腔狹窄程度，   這與雙層自體靜脈外支架頸外靜脈植入后對靶血管的影響結果一致［４７］ 。本研究中鎳鈦合金裸支架組術后出現的狹窄率僅為 13.14％ ， 遠低于覆膜支架狹窄率， 說明鎳鈦合金裸支架與傳統的裸支架不同， 不易引起支架內再狹窄。在術后早期， 覆膜支架可在一定程度上阻止內膜增生， 但在術后中遠期， 覆膜支架是否能持續抑制內膜增生， 預防血管再狹窄， 尤其是在血管建模缺口處保持較好的治療效果， 需要進行進一步研究。 但在本研究中，  與覆膜支架組相比，  鎳鈦合金裸支架組在抑制內膜增生、降低狹窄率、 減輕內皮損傷和炎癥反應方面仍體現出一定的優勢。然而， 對于鎳鈦合金支架在預防支架內再狹窄中的遠期應用效果和具體支架類型的選擇， 臨床尚需結合應用場景及患者條件進行深入研究。

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