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§ 來源：中國知網

§ 作者：朱福余 林振華 孫立魁 車國喜 屈秋錦 劉香東 劉增祥 劉成虎△

（山東省醫療器械和藥品包裝檢驗研究院 國家藥品監督管理局生物材料器械安全性評價重點實驗室 山東 濟南 250101）

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【摘要】

目的：建立植入了骨修復材料小型豬腰椎椎體骨組織標本的不脫鈣病理組織切片制備方法。方法：將含骨修復材料的腰椎椎體骨組織標本進行分割暴露組織切面，梯度濃度乙醇脫水后經 Technovit 7200 VLC 光聚樹脂浸潤，經黃藍光共同輻照進行光聚合包埋，借助硬組織病理切磨系統制備含骨修復材料不脫鈣病理組織切片。結果：結果顯示通過上述方法制備的病理組織切片，經蘇木精 - 伊紅（HE）染色及甲苯胺藍染色后光學顯微鏡下觀察能較好地顯示骨的各種組織細胞結構，可清晰的觀察到骨小梁的走向及連接情況。結論：研究建立了含骨修復材料骨組織標本病理組織切片制備方法，實現了含骨修復材料不脫鈣骨組織病理切

片的制備，經病理染色后實現了帶植入物的組織學觀察，為生物材料及醫療器械動物試驗研究提供了新的病理檢測手段及組織學評價途徑。

關鍵詞：小型豬腰椎椎體；含骨修復材料骨組織標本；樹脂包埋法；不脫鈣病理組織切片制備

中圖分類號：R-33；R318.08 文獻標識碼：A 文章編號：1673-6273（2023）06-1017-05

【前言】

用于骨修復的生物材料及器械在進行臨床試驗前均需要進行臨床前安全性和有效性動物試驗研究，以預測其應用于臨 床可能發生的不良作用[1，2]。骨修復材料的動物試驗研究需要制備合適的骨缺損動物模型，將骨修復材料植入到制備的骨缺損區域，評價骨缺損部位的局部炎癥反應、骨整合程度、骨重建情況，對該骨修復材料的安全性及有效性進行評價[3，4] 。生物材料及醫療器械動物試驗周期結束后，需要剖檢、取樣，切取連帶植入物及其周邊骨組織進行病理組織切片制備，以觀察生物材料及醫療器械與宿主骨組織結合界面的結合情況及其在動物體內的吸收降解情況 。與普通的石蠟包埋組織切片制備方法相比，埋置有植入物的骨組織標本進行組織切片制備時采用樹脂包埋病理組織切片制備方法不需要進行脫鈣處理，不需要額外剔除組織內埋置的植入物，可完整的觀察到植入物與宿主骨組織結合界面的組織反應情況，實現對植入物與骨組織結合界面組織細胞學變化的研究。本研究對植入了骨修復材料小型豬腰椎椎體不脫鈣病理組織切片制備方法進行了研究，以期能為相 關研究人員提供參考。

01材料與方法

1.1 材料1.1.1 組織標本 按照《醫療器械動物試驗研究注冊審查指導 原則 第二部分：試驗設計、實施質量保證（2021 年第 75 號）》進行骨修復材料產品安全性和有效性評價動物試驗研究方案的設計與實施[5]。試驗研究制備小型豬腰椎椎體骨缺損動物模型， 將委托方提供的骨修復材料植入到制備的缺損部位，動物試驗研究周期結束后獲得了植入了骨修復材料的腰椎椎體骨組織標本。1.1.2 主要試劑及儀器設備 主要試劑：10 %中性福爾馬林溶 液（購自濟南百博生物技術股份有限公司），無水乙醇（購自國藥集團化學試劑有限公司），蘇木精染液、伊紅染液及甲苯胺藍染色試劑盒（購自北京索萊寶科技有限公司），Technovit 7200 光聚樹脂（購自德國 EXAKT 公司）。主要儀器設備：E300CP 型 硬組織切片機、E400CS 型 硬組織磨片機、E402 型 平行粘片裝置、E510 型脫水浸潤儀、E520 型光固化包埋機、 E530 型 干燥滲透聚合裝置、E312 型 骨組織病理切割機（德國 EXAKT 公司）。1.2 方法1.2.1 組織標本的固定將切取下的小型豬椎體骨組織標本 放入 10 %中性福爾馬林溶液中進行固定，固定 24 h 后，更換新 的 10 %中性福爾馬林溶液，進一步繼續固定，固定時間不少于 1 周。1.2.2 組織標本的切割取材 將充分固定后的骨組織標本借 助 E312 型骨組織病理切割機切割為約 7 mm 厚度的標本，置 于 10 %中性福爾馬林溶液中繼續固定至少 12 h ，流水沖洗至 少 1 h，以水置換出組織中滲透的固定液。1.2.3 組織標本的脫水及浸潤 在抽真空條件下將固定充分經流水沖洗后的骨組織標本逐級浸入梯度乙醇進行脫水處理， 脫水程序見表 1 。在抽真空條件下將脫水完全的骨組織標本逐 級浸入不同體積比的 Technovit 7200VLC 樹脂 / 乙醇混合液中 進行浸潤處理，浸潤程序見表 2。

1.2.4 組織標本的光固化包埋聚合 取出浸潤完全的骨組織標本置入光固化包埋專用的模具中，加入光聚樹脂，借助 EX- AKT 530 干燥滲透聚合裝置進行抽真空處理，排凈包埋模具內 殘存的氣泡后進行固化聚合操作。固化過程由低強度的黃光與高強度的藍光共同輻照完成 ，先黃光輻照 6 h 后藍光輻照 8 h 完成骨組織標本的光固化聚合。含骨修復材料的腰椎椎體骨組織標本光固化包埋標本塊，見圖 1。

1.2.5 組織標本的平行粘片制作將聚合過的組織標本樹脂 包埋塊從包埋模具中取出 ，利用 Technovit4000 粘合劑套裝將 包埋有骨組織的樹脂包埋塊黏于載玻片上。經 EXAKT 300 CP 硬組織切片機切割 ，暴露出需要的組織切面 ，利用 EXAKT 400CS 硬組織磨片機對切面進行拋光處理 ，另取一張載玻片， 在 EXAKT 402 載片黏合裝置上用 Technovit 7210VLC 精密粘合劑將該載玻片黏附于標本塊的拋光面，組織標本的平行粘片即制作完成。

1.2.6 組織標本的切片及磨片 經 EXAKT 300CP 硬組織切 片機將包埋有組織標本的樹脂塊進行切割，一般將切割厚度設 為 200-300 μm，切片完成后，取下切片，經 EXAKT 400CS 硬組 織磨片機進行磨片操作，磨片過程中要用到不同規格的研磨紙和拋光紙，先進行粗磨，再進行精磨，最后進行拋光處理，將組織磨至 20 μm 左右 。含骨修復材料的腰椎椎體骨組織標本切磨片，見圖 2。

1.2.7 含骨修復材料組織切片的染色將制備的含骨修復材 料的組織切磨片經蒸餾水充分清洗后，進行病理染色 。含骨修復材料腰椎椎體骨組織病理切片 HE 染色方法：蘇木精染液 30 min，自來水充分沖洗，1 %鹽酸乙醇分化 30 s，流水沖洗后再入溫水返藍，置伊紅染色液 5 min，自來水沖洗，待組織切片自然干燥后經 Technovit 7200VLC 封片后，置光學顯微鏡下鏡檢觀察。含骨修復材料腰椎椎體骨組織病理切磨片甲苯胺藍染色方 法：將制備的骨組織標本病理切磨片置于體積分數 1 %甲苯胺 藍染液中 20 min 后，自來水充分沖洗，待組織切片自然干燥后 經 Technovit 7200VLC 封片后，置光學顯微鏡下鏡檢觀察。02    結果      

2.1 制備的含骨修復材料小型豬腰椎椎體不脫鈣骨組織病理切片 HE 染色結果通過上述方法制備了含骨修復材料小型豬腰椎椎體不脫鈣骨組織病理切片，經 HE 染色后，光學顯微鏡下觀察可見試驗研究植入的骨修復材料，呈淺灰色 。組織切片經 HE 染色后 細胞核呈藍色，胞質呈紅色，胞核、胞質著色對比鮮明，骨組織細胞未見移位變形，可清晰辨認骨的各種細胞成份，實現了含植入物不脫鈣骨組織的組織細胞學觀察，見圖 3。

2.2 制備的含骨修復材料小型豬腰椎椎體不脫鈣骨組織病理切片甲苯胺藍染色結果含骨修復材料小型豬腰椎椎體不脫鈣骨組織病理切片經 甲苯胺藍染色后，光學顯微鏡下觀察可見試驗研究植入的骨修復材料，呈淺灰色 。組織細胞經甲苯胺藍染色后，能較好地顯示骨的各種組織細胞結構 ，可清晰的觀察到骨小梁的走向及連接情況，可以觀察到植入的骨修復材料與宿主骨結合情況， 見圖 4。

03    討論     

骨組織標本采用石蠟包埋法進行病理切片制作時，必須先用乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、硝酸、甲酸等脫鈣液對骨組織標本進行脫鈣處理[6-8]。在骨組織內埋置有植入物的情況下石蠟包埋組織切片并不適用 ，原因是硬化后的石蠟雖具有一定的硬度，但其硬度不足以支撐去切組織內包埋的植入物，切片過程會造成蠟塊碎裂[9-11]。

樹脂包埋法制備病理組織切片與常規 " 石蠟包埋組織切 片 " 相比，制片步驟更為復雜繁瑣，制片周期更長，組織標本需 要歷經組織切割暴露切面、梯度乙醇脫水、不同體積比的 Tech- novit 7200VLC 樹脂 / 乙醇混合液浸潤、光聚合包埋、制備平行 粘片，切片、磨片，才可制備出一張不脫鈣的骨組織病理切片。上述報道的骨組織病理切片制備方法所適用的病理染色方法 少，這是其缺陷所在，造就了適用范圍受限 。同時，這種方法制 備病理切片周期長 ，僅組織標本的浸潤處理過程就需要近 40 天 。其優點是骨組織制片過程中不需要脫鈣處理，組織在埋置 有植入物的情況下，不需要剔除植入物，這是 " 石蠟包埋組織 切片 " 所實現不了的，上述報道的骨組織病理切片制備方法可 作為傳統的 、經典的 " 石蠟包埋組織切片技術方法 " 的補充。利用該技術方法制備含骨修復材料腰椎椎體不脫鈣病理組織切片時，需注意以下細節：（1）若切取的骨組織標本體積較大， 應延長固定時間且固定過程中，應多次更換新的固定液，骨組織標本經骨組織病理切割機分切后 ，應該繼續固定至少 12 h， 以使組織標本得到充分的固定 。（2）因不脫鈣的骨組織標本致 密緊實 ，應在抽真空負壓的條件下進行骨組織標本的脫水、浸潤處理，以使組織標本脫水充分，樹脂包埋液浸潤更加完全，更利于后續的組織切片制備。（3）進行光聚合固化包埋時，應先利 用干燥滲透聚合裝置抽真空 ，排凈包埋模具內殘存的氣泡，以 免影響組織塊的聚合、固化。（4）平行粘片制作過程中應利用磨 片機充分對需要觀察的組織切面拋光處理，以免出現組織切片 厚薄不一現象 。（5）在磨片時，磨盤轉速應設置的盡可能的低， 以免造成植入的骨修復材料與宿主骨組織脫離，致使長入骨修 復材料的新生骨組織丟失，影響后期的組織病理學分析。

與普通的石蠟包埋法病理組織切片制備方法不同，本研究 采用 Technovit 7200 VLC 光聚樹脂進行骨組織標本光固化包埋，借助 EXAKT 硬組織病理切磨系統制備骨組織標本的不脫 鈣病理組織切片，組織切片制備過程中所用的并不是傳統的病 理切片刀，而是鑲嵌有金剛石的無齒切割帶鋸，以 " 鋸 " 的形式對組織進行切割，制備組織切片 。該方法制備的病理切片最 顯著的特點是不需要對骨組織進行脫鈣處理，可使骨組織結構 形態保持完好，骨的礦化結構不被破壞，可用于含金屬、陶瓷、 骨水泥等骨修復材料的臨床前安全性和有效性的骨缺損修復 動物試驗研究[12] 。同時，該技術方法制片過程中不需要剔除植 入到骨組織中的植入物，保持了骨組織與植入物之間原有的組 織結構形態，可直觀反應結合界面的組織生長結合情況，這對 骨缺損修復試驗的組織長入研究具有重要意義，可用于 3D 打 印多孔洞類材料組織長入等生物組織相容性研究[13]。

生物材料及醫療器械動物試驗研究的目的是預測其應用 于臨床可能發生的不良反應，是醫療器械臨床前安全性評價必須進行的一項試驗研究[14]。動物試驗研究組織病理學評價是該評價體系中重要的一環，用以確定產品組織相容性，是評價其安全性并判定是否可以應用于臨床的重要研究手段[15，16] 。樹脂包埋法制備病理組織切片無需進行脫鈣處理，在動物試驗研究中結合動物活體親骨熒光素標記技術，可實現動態測量骨修復過程中的新生骨礦化率和礦化速率 ，進行骨形態計量學研究[17，18] 。制備的病理組織切片最顯著的特點是不破壞植入到骨組織中的植入物，保持了骨組織與植入物之間原有的組織結構 形態，該技術方法結合掃描電鏡技術，可實現觀察成骨細胞在骨修復材料表面及孔隙內附著及生長情況，從而判斷骨修復程 度，同時結合掃描電鏡技術可實現觀察骨修復材料表面侵蝕及 骨質沉積情況的研究[19-22]。

20 世紀 80 年代，為研究骨組織的礦化程度及新骨形成情 況，塑料包埋技術開始應用于骨組織病理切片的制備，近年來許多實驗室在塑料包埋方法上進行了創新，特別是在包埋聚合 液及其聚合條件方面做了多種改進[23-26] 。有文獻報道用甲基丙 烯酸甲酯（MMA）及鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）為滲透劑，甲基丙烯酸甲酯為包埋劑，包埋聚合制備骨組織塑料包埋切片的技術方法，但這一制片技術因操作煩瑣，制作周期長，且塑料包埋 塊制備過程復雜，組織切片制備過程對溫度要求高，目前該技術方法仍然在用，但未得到廣泛應用[27，28]。本研究制備不脫鈣骨組織病理切片包埋劑采用的是光聚樹脂，通過黃光與藍光共同輻照完成組織包埋塊的包埋聚合 ，與傳統的 " 石蠟包埋組織切片 " 方法及 " 塑料包埋技術 " 組織切片方法制備骨組織病 理切片所用的包埋劑不同 ，組織標本的浸潤處理及切片方式 也不同。

本研究制備的含骨修復材料腰椎椎體不脫鈣病理組織切片，光學顯微鏡下可清晰觀察骨缺損部位植入骨修復材料后組 織結合界面骨的各種組織細胞結構，可進行骨缺損修復后骨組 織重建進程及炎癥反應研究，適用于生物材料及醫療器械臨床前動物試驗安全性評價的組織病理學研究。