- 中國實驗動物學報 第32卷 第2期 2024年2月
竇新雨1 , 2 , 3 , 劉宇1 , 2 , 3 , 劉嘯1 , 2 , 3 , 祝斌4 , 賈斐5 , 王霖邦1 , 2 , 3 , 金攻6 , 沈飛7 ? , 劉曉光1 , 2 , 3 ?
( 1. 北京大學第三醫院骨科，北京 100191;2. 教育部骨與關節精準醫學工程研究中心，北京 100191 ;3. 脊柱疾病研究北京市重點實驗室，北京 100191;4. 首都醫科大學附屬北京友誼醫院骨科， 北京 100050;5. 山東第一醫科大學附屬省立醫院脊柱外科，濟南 250000;6. 中奧匯成 科技股份有限公司，北京 100176;7. 北京大學第三醫院實驗動物中心，北京 100191)
目的 頸椎間盤突出癥( cervical disc herniation , CDH) 是骨科常見疾病之一，隨著對該疾病研究的深 入及頸椎內植物的發展，建立頸椎融合動物模型成為不可或缺的部分，目前國內對頸椎融合動物模型建立及評估 的研究報道較少，本研究以期為頸椎融合相關研究提供完備的動物模型和內植物性能的評估方案 。方法 選擇小尾寒羊，改良術式后行頸椎前路椎間盤切除融合術( anterior cervical discectomy and fusion , ACDF) , 將聚醚醚酮 ( polyetheretherketone , PEEK) 椎間融合器( interbody fusion cage , Cage)（對照組）、3D 打印鈦合金 Cage（ 實驗組 1) 及新方法鈦合金 Cage（實驗組 2) 分別植入每只羊的不同頸椎節段( C2/3 ~ C4/5) , 術后行血液學檢測、組織病理學分析評估手術恢復情況及材料生物安全性，利用 X 光、CT、Micro?CT 及定量分析、硬組織切片染色、生物力學試驗評估內植物的骨長入及骨融合情況 。結果 綿羊改良術式 ACDF 模型建立成功，血液學檢測重要指標無顯著性差異 ( P > 0. 05) , 組織病理學分析顯示均無炎癥細胞浸潤等病理改變，內植物生物安全性良好，X 光及CT 顯示內固定位置及椎間融合情況良好，術后3個月及6個月 Micro?CT 及定量分析表明，與 PEEK Cage 組相比，新方法鈦合金Cage 組及 3D 打印鈦合金 Cage 組內部的骨體積／總體積、骨小梁數目顯著性升高( P < 0. 01) , 骨小梁間距顯著性降 低( P < 0. 01) , 且新方法鈦合金 Cage 組骨質長入更多( P < 0. 01) , 硬組織切片染色表明新方法鈦合金 Cage 組及 3D 打印鈦合金 Cage 組孔隙內有明顯骨質長入且較為密實，結合較 PEEK Cage 組略好，生物力學試驗顯示，與 PEEK Cage組相比，新方法鈦合金Cage及3D打印鈦合金Cage在一定程度上降低了頸椎屈伸、側彎、扭轉運動范圍 ( P < 0. 05) , 同時增強了頸椎的穩定性，且新方法鈦合金 Cage更有優勢( P < 0. 05) 。結論 建立綿羊改良術式 ACDF 模型后，利用合理有效的評估方法，證明了該模型的合理性及有效性，同時說明 3 種材料的 Cage 均顯示出良好的生物安全性，新方法鈦合金 Cage 及 3D 打印鈦合金 Cage 較 PEEK Cage 的骨長入及骨融合性能更強，可增強頸椎的穩定性，且新方法鈦合金 Cage 更有優勢。
【關鍵詞】 頸椎前路椎間盤切除融合術；頸椎間盤突出癥；綿羊模型；椎間融合器
【 中圖分類號】Q95-33 【 文獻標志碼】A 【 文章編號】1005?4847 (2024) 02?0139? 12
頸椎間盤突出癥( cervical disc herniation , CDH) 作為脊柱外科常見疾病之一，是指頸椎間盤髓核突破纖維環，向后方壓迫脊髓或向后外側壓迫頸神經根而引起相應癥狀的疾病，以頸部酸脹疼痛、活動受限、上肢放射性疼痛麻木及下肢踩棉花感為主要癥狀[1] 。近年來，CDH 發病表現出年輕化趨勢，嚴重影響了患者的工作及生活質量，給社會和經濟帶來嚴重的負擔 。CDH 的治療手段多樣，保守治療方案包括藥物、針灸[2] 、理療[3] 等，此外，介入治療也在不斷發展[4] 。當頸椎間盤突出較重，保守及介入治療后反復或無效時，手術則成為重要的治療手段 [5-6] , 根據頸椎間盤突出的數目及類型，目前臨床常用手術方案包括頸椎前路椎間盤切除減壓融合 術( anterior cervical discectomy and fusion , ACDF) 、頸椎后路單開門椎管擴大成形術、頸椎后路雙開門椎管擴大成形術及微創手術等，其中，ACDF 手術較為 常見且有效[7] 。近年來，隨著對 CDH 研究的深入及脊柱外科中頸椎內植物材料的發展，對相應頸椎融合動物模型的需求不斷增大，建立理想且完備的動物模型及評價體系迫在眉睫 。小尾寒羊作為偶蹄目牛科羊屬綿羊種動物，已被證明在頸椎解剖結構、生物力學、 骨密度及放射學特性上類似于人體頸椎，其中 C3/4 節段與人體頸椎最為相似[8] , 可作為理想的頸椎動物模型[9- 10] 。因此，本研究基于此，選擇小尾寒羊作為實驗動物，對手術方式進行革新，建立頸椎前路椎間盤切除融合模型，植入椎間融合器 ( interbody fusion cage , Cage) , 后續采取一系列檢測方案，對手術安全性及植入物融合效果進行系統評估，以期為頸椎相關研究提供完善的動物模型方案。
18 只 24 月齡普通級雄性健康小尾寒羊，體重約 30 ~ 35 kg,購于北京富龍騰飛實驗動物研究院有限公司【SCXK（京）2023-0009】，所有小尾寒羊采取自由飲水及定時普通牧草飼料喂養，晝夜各半循環照明，濕度適宜且恒定（ 相對濕度為 50%) , 溫度控制在 22 ~ 26℃ 。飼料由北京科澳協力飲料有限公司【SCXK（京）2020?0010】提供，手術及采食飼養2021-0054】進行 。飼養環境：普通級環境 。動物倫理通過北京大學第三醫院倫理 委員會批準( A2022064) 。聚醚醚酮( polyetheretherketone , PEEK ) 頸椎Cage（ 山東康盛，中國）、3D 打印鈦合金Cage（愛康，中國）、新方法鈦合金Cage（中奧匯成科技股份有限公司，中國）、頸前路螺釘及鈦板系統 ( Stryker, 美國）、可吸收縫線( Ethicon , 美國）、4%多聚甲醛溶液 ( G1101 , 賽維爾，中國）、甲基丙烯酸甲酯光聚樹脂 ( TECHNOVIT 7200 , EXAKT , 德 國）、糊狀黏合劑 ( TECHNOVIT 4000 , EXAKT , 德 國）、精 密 粘 合 劑 ( TECHNOVIT 7210VLC , EXAKT , 德國）、塑料載玻 片 ( EXAKT , 德 國 ）、甲苯胺藍染色液試劑盒 ( G3663 , 索萊寶，中國）、亞甲基藍染色液(G1303,索萊寶，中國）、酸性品紅(F8220,索萊寶，中國）、Goldner三色染色液試劑盒( G3550,索萊寶，中國）、蘇木精?伊紅染色試劑盒( C0105S , 碧云天，中國）。
頸椎前路器械包( Stryker, 美國）、骨科手術器械包、C型臂X光機（聯影，中國）、計算機斷層掃描 ( computerized tomography, CT)機（聯影，中國）、生物力學試驗機( MTS 858 Mini Bionix Ⅱ , 美國）、光學測CT) 機( Siemens , 德國）、硬組織切片機( EXAKT , 德 國）、脫水浸透儀( EXAKT,德國）、光固化包埋儀( EXAKT , 德 國 ）、NanoZoomer 全景掃描顯微鏡( Hamamatsu photonics , 日本）、光學顯微鏡( OlympusBH?2, 美國）。
18 只小尾寒羊采取隨機數表法分組，每 3 只為 1 組，設置 6 組平行組，每平行組中每只羊植入 3 種 不同材料的椎間融合器 。隨后，再以每節段頸椎為 觀察分組單位，根據每節段頸椎植入的材料種類， 劃分 PEEK Cage 為對照組，3D 打印鈦合金 Cage 為 實驗組 1 , 新方法鈦合金 Cage 為實驗組 2 , 平行組中 每只羊植入 Cage（見表 1) 。
術前禁食24h , 不禁水，頭皮針穿刺頸靜脈并固定，5 mg/kg 丙泊酚推注，達到麻醉狀態（ 頭頸及四肢癱軟，針刺無反應）后，行氣管插管( 9. 5 ~ 10. 5 號氣管插管），異氟烷吸入麻醉，潮氣量10mL/kg ,呼吸次數每分鐘 18 ~ 20 次，異 氟 烷 濃 度 2% ~2. 5%維持麻醉，靜脈持續泵入美洛昔康注射液0. 05mg/( kg·h) 持續鎮痛，選擇仰臥位，將羊用繃帶固定于手術臺上，肩下墊枕，用C型臂 X 光機進 行透視定位 C2/3 , 常規消毒鋪巾，行頸部中線右側縱行長切口（切口長約12cm) , 逐層切開皮膚、皮下組織、頸闊肌，由頸血管鞘及內臟鞘之間入路，顯露并縱行切開頸前筋膜，找尋頸長肌，于頸長肌兩頭間隙進入，顯露3節椎體及椎間隙( C2 ~ C5 ) 。用咬骨鉗去除椎體正前方突出的骨脊，鉆孔擰入撐開固定釘，安放撐開器，撐開椎間隙，用小圓刀切開纖維環，利用頸椎刮匙、髓核鉗等切除椎間盤，刮除椎體上下終板軟骨，利用椎板鉗將上、下椎體終板突出的弧形骨質去除，生理鹽水沖洗，植入Cage ( 3D 打印 Cage 及新方法鈦合金 Cage 不植骨，PEEK Cage 植入減壓咬取的松質骨），松開撐開器使其嵌入椎間隙內，拔除撐開固定釘，用合適長度的頸前路 4 孔鈦板及螺釘系統行內固定，上下椎體各擰入 2 顆螺 釘，行 X 光透視定位評估位置良好，徹底沖洗后，放置引流管一根，逐層縫合頸闊肌及皮下組織，關閉切口， 無菌敷料包扎傷口，觀察術后活動及精神狀態。
1. 2. 3 動物模型術后評估及取材
術后即刻行頸椎正側位 X 光檢查（ 目標節段為 C2/3 ~ C4/5 ) , 術后 2 個月行頸椎 CT 檢查、血常規、C反應蛋白及血清堿性磷酸酶水平檢測，評估術后恢復情況 。術后 3 個月處死 3 組平行組取材，另 3 組于術后 6 個月處死取材，行相關標本檢測，評估頸椎融合效果。
1. 2. 4 X 光檢查
術后即刻及術后 2 個月行頸椎正側位 X 光，評估手術內植物及內固定位置情況。
1. 2. 5 頸椎 CT 檢查
術后 2 個月對羊模型行頸椎 CT 檢查（ 目標節 段為 C2/3 ~ C4/5) , 靜脈注射戊巴比妥鈉( 30 mg/ kg) 進行短期鎮靜，電流為200 mA , 電壓為120 kV , 視場 21 cm , 切片厚度為 3 mm , 評估手術內植物位置及骨質生長情況。
1. 2. 6 血液學檢測
術后 1 個月行血常規、C 反應蛋白檢測，評估動物術后炎癥情況，驗證內植物的生物安全性，行血清堿性磷酸酶水平檢測，評估動物成骨相關功能。
1. 2. 7 生物力學試驗
處死羊模型后，將羊頸椎剔除所有肌肉組織，保留韌帶、椎間盤，采用椎體整塊切除術( en?block)獲得每段功能脊柱單元標本后[11] , 螺釘穿過每個標本上下位椎體，包埋在聚甲基丙烯酸甲酯中，于生物力學試驗機內固定，采用光學測量系統，在 2. 5 Nm 的純力矩下，分別在屈伸、左右側向彎曲和左右軸向旋轉 3 個運動平面上進行柔韌性測試 。施加力矩的速率約為 0. 5 °/s , 重復 4 個完整的過程加載循環，其中前 3 個循環用于減少粘彈性效應，第 4 個循 環用于分析 。所有標本在室溫下測試，測試出每個標本的運動范圍( range of motion , ROM , ROM 定義為最小彎矩和最大彎矩期間的角位移），并比較其運動學行為。
1. 2. 8 Micro?CT 檢查及定量分析
術后 3 個月處死 3 組羊模型取材，另 3 組于術后 6 個月處死，采用 en?block 方式對羊頸椎進行取材 。對頸椎標本進行 Micro?CT 掃描，掃描速度為6 °/min,分辨率為 9 μm。X射線源電壓為80kV,束電流為80mA。使用多模態三維可視化軟件 InveonResearchWorkplace對掃描結果進行重建和分析。通過劃分不同的閾值單位(hounsfield,HU)來區分骨組織、軟組織和鈦合金Cage并進行后續定量分析。骨組織定義在 1000 ~ 2250HU范圍內，金屬定義為大于2250HU,軟組織在0 ~ 1000HU。重建后選擇植入物周圍500μm區域和植入物內部孔隙空間作為感興趣區域(region ofinterest,ROI)。在ROI中，骨體積／總體積(bone volume/total volume,BV/TV)、骨 表 面 積／骨 體 積( bonesurfacearea/bonevolume,BS/BV)、骨小梁數目 (trabecularnumber,Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb. Th)和骨小梁間距(trabecular spacing,Tb. Sp)通過InveonResearch Workplace直接計算得到，以此評估內植物骨長入及手術節段頸椎融合情況。
1. 2. 9 硬組織切片
將術后 3 個月及 6 個月處死羊模型獲得的頸椎標本，用 4%多聚甲醛預固定1d。采用硬組織切片機修剪標本成適當形狀，盡可能減小組織塊的體積以便加快脫水浸塑的進程 。然后正式固定于 4%多聚甲醛中 2 周 。將固定后的標本用流水沖洗 15 min 后置于脫水浸透儀中，真空環境下于梯度乙醇中震蕩脫水( 1000 mbar, 振蕩頻率每分鐘 40 ~ 50 次）， 分別為 40%乙醇 3 d、75%乙醇 3 d、95%乙醇 3 d、無 水乙醇 3 d。之后將標本塊置于甲基丙烯酸甲酯 TECHNOVIT 7200 光聚樹脂中浸塑 7 ~ 14 d。將完成脫水浸塑程序的標本放于包埋盒中，倒入光聚樹脂，置于光固化包埋儀包埋，采用黃光照射5 h、藍光 照射10 h固化 。包埋完成后將包埋好的標本塊取出放在 60 ℃ 烘箱中 10 h 至徹底固化 。依照說明配制 TECHNOVIT 4000 糊狀黏合劑，用黏合劑將標本粘于塑料載玻片上，用于制作硬組織切片 。先將標本用真空泵吸附在硬組織切片機上 。將標本沿植入體縱軸切開至顯露出金屬內植物，800#砂紙拋光、干燥 。然后用TECHNOVIT 7210VLC精密粘合劑將載玻片粘貼于標本上方，用金剛石鋸切取厚度為 200 ~ 300 μm 的薄片，分別用 800#、1200#及 2000# 砂紙磨至 80 ~ 100 μm。重復上述操作，每個樣本制備 5 張硬組織切片以供后續染色及組織學分析。此后，應用甲苯胺藍染色液試劑盒、亞甲基藍?酸性品紅染色液以及 Goldner 三色染色液試劑盒染色， 使用 NanoZoomer 全景掃描顯微鏡和光學顯微鏡拍攝其整體和局部，觀察 Cage 內骨長入及與周圍椎體的成骨融合情況。
1. 2. 10 組織病理學分析
術后6個月處死羊模型后，隨機抽取 3 只羊，選取心臟、肝、脾、肺、腎組織在 4% 的多聚甲醛中固定，將樣品脫水后包埋于石蠟中行連續切片，采用蘇木精?伊紅( hematoxylin?eosin , HE) 染色，使用光學顯微鏡行鏡檢及圖像采集，評估內植物對動物主要臟器的影響。
1. 3 統計學分析
計量資料用平均值 ± 標準差( x- ± s ) 的形式表 示 。所有數據均采用SPSS 22. 0 和 GraphPad Prism 8. 0. 2 軟件進行統計學分析，兩組以上的比較采用單因素方差分析( One?way variance , ANOVA) , 兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗 。以 P < 0. 05 表示具有統計學意義。
2 結果
2. 1 手術效果及術后恢復情況
行術前準確定位后+ 圖1A),所有建模手術均順利進行，解剖及操作要點見圖1B~1I,術后動物站立及四肢活動良好，精神狀態可，除有1只羊術后存在異物排斥反應，致使傷口愈合緩慢外（后行數次傷口換藥，傷口逐漸恢復），其余均無傷口滲液、感染等發生。所有模型自術后至處理期（喂養 3個月及 6個月）均無神經損傷表現，進食活動良好，體重正常增長。
2. 2 影像學檢查結果 2. 2. 1 X 光檢查
術后即刻行頸椎正側位 X 光，觀察到間盤處理充分，手術內植物及內固定位置良好，提示羊頸椎前路椎間盤切除融合模型建立成功（ 圖2A) 。
2. 2. 2 頸椎 CT 檢查
術后2個月行頸椎 CT,觀察到羊模型手術節段頸椎間隙部分融合，不同材料Cage內均有骨質長入，內固定前方骨質增生（圖 2B),在CT三維重建圖像中該結果也得到了驗證（圖2C)。
2. 3 術后血液學檢測
術后 1 個月行血液檢測，結果顯示各平行組血常規正常，重要指標組間無顯著性差異(P > 0.05)（圖 3A ~ 3J),C 反應蛋白結果表明未有感染發生（均< 5.0mg/L),各組血清堿性磷酸酶水平均高于正常值上限(100 U/L),提示成骨活躍（圖 3K),上 述檢測表明手術建立模型的成功以及內植物良好的生物安全性。
2. 4 生物力學試驗
為了研究不同材料 Cage 對頸椎 ROM 和頸椎穩定性的影響，本研究對術后 6 個月頸椎樣本進行了一系列生物力學試驗 。結果如圖 4 所示，對照組與實驗組 1 及實驗組 2 相比，在屈伸（ 圖 4A) 、側彎（ 圖 4B)、扭轉（圖 4C)的關節活動度差異均有顯著性(P < 0.05),表明了新方法鈦合金 Cage及 3D 打印鈦合金 Cage在一定程度上降低了頸椎的 ROM,同時增強了頸椎的穩定性，且新方法鈦合金 Cage更有優勢(P < 0.05)。
2. 5 Micro?CT 檢查
為了評估不同材料 Cage 的骨長入及骨融合性能，本研究通過Micro?CT,對術后3 個月及6 個月Cage內部及與椎體接觸面的骨質進行了評估。如圖 5A所示，在二維圖像上，Cage內部及接觸面的新生骨質被標記為黃色，相比于PEEKCage組，新方法鈦合金 Cage組及 3D打印鈦合金 Cage組在兩個區域都有更多的骨形成。根據Micro?CT,不同材料組內部及表面骨長入相關指標（如 BV/TV、BS/BV、Tb.N、Tb.Th、Tb. Sp)的定量分析結果如圖 6所示，結果表明，術后3個月及6個月，新方法鈦合金Cage組及 3D 打印鈦合金Cage組內部的BV/TV、 Tb.N顯著性升高(P < 0.01),Tb. Sp顯著性降低(P < 0.01),且新方法鈦合金 Cage組骨質長入更多(P < 0.01),而在BS/BV、Tb.Th上無顯著性差異（除術后6個月時新方法鈦合金 Cage組在Tb.Th上 明顯低 于PEEKCage組外，P>0.05)。此外，Micro?CT三維重建圖像(Cage被標記為白色，內部及接觸面的新生骨質被標記為藍色）證實，新方法鈦合金 Cage 組的骨長入及骨融合性能優于 3D 打印 鈦合金 Cage 組及 PEEK Cage 組（ 圖 5B) , 這表明， 新方法鈦合金 Cage 更能增強椎間骨長入及融合。
2. 6 硬組織切片及染色
對術后 6 個月不同材料 Cage 組標本行硬組織切片，隨后使用甲苯胺藍、亞甲基藍酸性品紅、Goldner 三色 3 種不同方式染色，結果如圖 7 所示， 對于 PEEK Cage 組，因其內部有填入的自體骨質， 6 個月時 Cage 中心骨質連接完整，與上下終板融合為一體，但Cage表面與椎體界連接處有明顯的空隙，提示骨界面結合較差。對于新方法鈦合金 Cage 組及 3D打印鈦合金 Cage組，術后6個月時 Cage 的孔隙內有明顯骨質長入且較為密實，Cage表面與椎體骨界面雖也有空隙，但結合較PEEKCage組略好。
2. 7 組織病理學分析
對術后6個月隨機抽取的羊模型心臟、肝、脾、 肺及腎組織行HE染色，由染色結果分析可得，各組間羊模型的重要器官組織形態正常，均無炎癥細胞浸潤等病理改變（ 圖 8) , 證明了材料具有良好的生物安全性。
3 討論
目前，骨科新材料研究如火如荼，尤其在脊柱外科內植物方面取得了重要突破（如人工椎體[12] 、人工椎間盤[13] 、椎間融合器[14] 、脊柱內固定系統 [15- 16] 等），其中，頸椎內植物相關研究的飛速進步對頸椎融合動物模型的建立提出了更高的要求。 通過建立頸椎融合動物模型，可驗證頸椎內固定器材的生物相容性及穩定性，亦可評估內植物材料或 生物制劑對于骨融合的效果 。因綿羊頸椎在解剖結構、前凸程度、材料性質及生物力學上與人體頸椎具有較高的相似性，其模型在國內外頸椎研究中已被廣泛應用，成為了此類研究中必不可少的研究 工具及手段[17- 19] 。此外，由于綿羊頸椎間盤具有高度較大的特點，也使其頸椎融合模型成為評估頸椎內植物的理想模型[20] 。然而，國內對于綿羊頸椎融合模型的建立及評估方法的研究較少，本研究通過改良手術方案建立小尾寒羊 ACDF 優化模型，植入3種不同材料的 Cage , 而后制定較為完備的評估方法以評價不同 Cage 的骨長入及骨融合性能，以期為后續研究者提供思路。本研究選取 ACDF 手術方式建立小尾寒羊頸椎融合模型，與常規 ACDF頸椎融合動物模型建立時采用頸部橫行切口不同的是，本研究采取改良術式，對模型手術方式進行優化，在符合動物倫理的要求下，采用頸部縱行切口，以縮減頸部切口數量，此外，縱行切口也便于選擇合適的手術入路，以減少手術過程中對羊的損傷。該優化術式在多節段頸椎間盤的處理中具有優勢，可充分利用羊頸椎節段，具有一定的經濟實用性及有效性。行手術解剖入路時發現，綿羊的頸闊肌只有薄薄一層，切開時要特別注意不要損傷深部組織，電凝止血后由頸血管鞘及內臟鞘入路，剝開頸前筋膜，發現頸長肌一般為分叉狀，從肌肉分叉處進入，可減少對于肌肉的損傷以及出血，認為這是很重要的。減壓融合可按常規手術進行，值得注意的是，因綿羊的下位椎體前端終板有弧形凸起，且綿羊椎體后緣較前緣略高，應當用椎板鉗將間隙仔細處理成平臺狀，才可便于置入椎間融合器。術后切記密切觀察綿羊蘇醒后四肢活動情況、進食及精神狀態，以確保術中無神經損傷的發生。值得注意的是，在術后恢復期，因進食及生活習性，綿羊無法像人類行頸托制動控制頸椎大幅度的活動，但本研究發現該問題并未影響術后內固定的穩定度及并發癥的發生，反而因其術后早期開始頸部活動，頸部活動度恢復更佳。此外，在觀察期內，未發現內固定松動及神經損傷的表現，日常活動及進食正常。對于實驗分組方案，本研究將 3種不同材料 Cage分別植入每只羊的不同頸椎節段，這可以消除因個體差異產生的誤差。但由于不同頸椎節段生物力學性能、椎間隙高度、所承受的應力等存在差異，因此本實驗將同一材料 Cage植入每平行組中羊的不同頸椎節段，確保每組羊中同一頸椎節段均有同種材料 Cage植入，通過設立多組平行組的方法，使實驗設計符合統計學要求。對于模型評估方案，本研究選擇血液學檢測、組織病理學分析、影像學檢查、Micro?CT 檢查及分析、硬組織切片染色分析、生物力學試驗等手段，充分涵蓋了對于材料的生物安全性、骨長入及骨融合性能以及頸椎生物力學方面的評估。血液學檢測反映出動物體內有無貧血、炎癥反應發生及成骨活躍情況，重要器官組織病理學分析展現了內植物對于各器官有無病理損害，上述檢測方案可證明內植物的生物安全性[21-22] 。影像學檢查中，X光可以評估術后內固定位置及神經減壓情況，活體頸椎CT檢查反映出術后 2個月頸椎間隙高度及融合情況，需要注意的是，CT顯示椎間隙前方內固定被骨組織包裹，手術節段椎體被骨橋連接一體，這反映了綿羊極強的成骨功能，在頸椎屈伸活動時有極高的穩定性，這一點也在取材時大體標本上得到證明。Micro?CT 檢查及分析可以更直觀地反映術后 3 個月及6個月標本中內植物中骨長入及與椎間隙融合情況，并能通過計算相關指標來量化這些改變，使得評估更為細致，更具可信度[23] 。此外，選取硬組織切片染色及軟件定量分析方案，能更有對比性且更為客觀地反映出內植物內新骨生成情況，使結果更具說服力[24] 。作為評估脊柱活動度及穩定性的重要方法，生物力學試驗重要性不言而喻[25] , 本研究通過生物力學試驗機，測定頸椎屈伸、側彎及軸向旋轉的運動范圍，可用于評價不同內植物的骨融合及脊柱穩定性。根據本研究結果，3 種材料均展現出了良好的生物安全性；在骨長入及骨融合性能方面，新方法鈦合金 Cage及 3D打印鈦合金 Cage更有優勢，且新方法鈦合金 Cage性能更佳；在生物力學方面，新方法鈦合金 Cage及 3D打印鈦合金Cage在一定程度上降低了頸椎的ROM,同時增強了頸椎的穩定性，且新方法鈦合金Cage更有優勢。上述結果證明了兩實驗組材料可以有效地維持椎間隙高度，促進骨長入及椎間融合，術后無明顯炎癥反應及并發癥發生，表明材料在動物體內具備良好的安全性以及有效性。因此，本研究在成功建立小尾寒羊頸椎ACDF優化模型的同時，也為材料的臨床應用奠定了前期動物實驗基礎。
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