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【艾佧薦讀】骨膜下植骨技術修復兔口腔種植體頰側骨缺損的實驗研究 2025年02月15日
  • 來源：中國知網
  • 齊齊哈爾醫學院學報 2024 年第 45 卷第 21 期
  • 于海洋 楊晶


【摘要】

目的 探究骨膜下植骨( Sub－periosteal Peri－implant Augmented Layer，SPAL) 技術對于修復種植體頰側骨缺損的組織學可靠性。方法 選取20只日本大耳白兔，應用隨機數表法將其分為引導骨再生( Guided bone regeneration，GBR) 組(A組) 和SPAL組(B組) 兩組，每組各10只。拔除兔下頜切齒同期植入種植體建立骨缺損模型。骨增量 A 組采用 GBR技術，B組采用 SPAL 技術。術后即刻、1個月、3個月、6個月取材進行 Micro CT 掃描及組織學觀察。結果 實驗操作可實現理想骨充填，術后 1個月時，B組種植體頰側多個水平層面骨壁厚度及整體骨體積均明顯高于A組。術后 3個月時，B組種植體頰側骨量高于A組，差異具有統計學意義( P＜0.05) 。術后6個月時，兩組種植體頰側最終骨量趨于等量。組織學觀察可知，兩組種植體頰側均可實現成熟板層骨結構。結論 SPAL 骨增量術后無纖維組織長入成骨區，術后6個月可實現種植體骨結合及頰側骨再生，效果與傳統 GBR技術無顯著差異。且骨膜替代人工屏障膜有利于維持原始骨壁，具有更好的空間維持作用。

【關鍵詞】 骨膜;屏障膜;骨再生;種植體

［中圖分類號］Ｒ78 ［文獻標識碼］ADOI: 10.3969 /j.issn.1002－1256.2024．21.003



在臨床中，牙齒缺失后牙槽嵴頰側發生不同程度的水平向骨缺損的情況是非常常見的。這是由于隨著牙槽窩愈合過程中的骨改建和重塑［1］，剩余牙槽嵴會發生一定程度的萎縮。其中，垂直向骨吸收通常為2~4 mm，且當鄰牙存在時吸收量更少，而水平向骨吸收可達 5~7 mm,相當于原牙槽嵴寬度的一半［2-3］。其中，頰側骨板吸收量又要遠遠多于舌側。

種植修復的目的在于恢復口腔功能及美學效果; 保證遠期的穩定; 減少并發癥風險。其中，保證遠期穩定性的關鍵在于要確保種植體全部位于健康的牙槽骨內，且骨壁厚度至少 1.5 mm［4-6］。當種植體頰側骨壁存在裂開型骨缺損時，發生種植體周圍炎的風險會大大提高［7-8］，且軟組織并發癥增多。當種植體頰側骨壁完整但厚度＜1.5 mm 時，術后2個月該位點會發生約3mm 的垂直向骨吸收; 而當頰側骨壁

厚度＞1.5 mm 時，遠期骨量基本保持穩定［9］。綜上所述，無論是種植體頰側存在骨缺損還是頰側骨壁完整但厚度＜1.5 mm，都必須進行骨增量手術恢復頰側骨壁厚度。

GBR技術是目前口腔種植臨床中最常用的骨增量術式［10］。GBR的原理就是通過屏障膜的應用阻止缺損區內增殖較快的上皮細胞和成纖維細胞長入，從而保證增殖速度較慢的成骨細胞和血管能夠優先長入屏障膜下方血凝塊占據的間隙內［11］。但由于 GBR術中的骨膜減張切口破壞了骨膜結構的完整性，損傷了骨膜生發層，使得骨膜的成骨潛能在 GBR術式未能得到充分利用。

SPAL是一種種植同期修復頰側骨缺損的新型術式［12］。通過對頰側瓣進行半厚分離，外層黏膜瓣可達到無張力的冠向復位，實現傷口的嚴密關閉。內層完整的骨膜瓣不僅降低了手術創傷，同時為骨膜成骨潛能的發揮奠定了解剖學基礎。由于避免了人工屏障膜的使用，手術成本大大降低。在Trombelli 的臨床研究中確實報道了理想的成骨效果。但目前SPAL 技術缺乏對種植體周骨水平的長期追蹤，成骨質量以及骨再生過程中是否有纖維組織長入不得而知。本研究欲通過動物實驗，探究 SPAL 技術對于修復種植體頰側骨缺損的組織學可靠性。



01
材料與方法


1.實驗動物: 選取20只日本大耳白兔,雄性,1~2 歲齡,平均體重 2.5~3.0kg，口腔內無疾患。應用隨機數字表法將其分為 GBR 組( A 組) 和 SPAL 組( B 組) 兩組，每組各10只，每只兔下頜可提供2個實驗位點。

2.設備和材料: (1) 鈦合金種植體3.5mm×8mm及配套覆蓋螺絲; (2) 骨增量材料 Gesitlich Bio-Oss，Gesitlich Bio-Gide; (3) 常規手術器械; (4) 打磨機;(5) 小動物顯微 CT( Micro CT，Bruker Skyscan1276) ;(6) EXAKT 300PC 硬組織切片機( 德國 EXAKT公司) ; (7) EXAKT 400 磨片機( 德國 EXAKT 公司) ;(8) 研磨砂紙( 320、800、1200、4000目，德國) ; (9) 生物顯微鏡( 奧林巴斯 BX53) 。


3.研究方法: (1) 手術方式: ①術前準備: 實驗前3天確認實驗動物身體精神狀況良好，可以承受外科手術操作。對實驗動物進行稱重，按照300mg /kg 應用全麻藥物。肌內注射全麻藥物鹽酸賽拉嗪注射液后，等待3~5min，若動物仍與麻醉前活躍程度相似，則再次給予異氟烷吸入性麻醉藥物，增強麻醉效果2~3min 后，可見動物活躍度明顯降低。使用棉絮輕輕觸及動物眼瞼緣，檢查動物眼瞼反射消失，同時觀察到瞳孔縮小，拉動動物四肢無肌張力后，表明實驗動物已進入手術麻醉狀態。將實驗動物仰臥，四肢用繃帶纏繞固定于兔臺上，使用棉簽蘸取碘伏消毒液充分擦拭動物口腔內部及上下唇，鋪無菌孔巾。②翻瓣及微創拔牙: 于實驗動物下頜兩顆切齒的頰側齦頰溝處再次局部注射阿替卡因腎上腺素注射液行浸潤麻醉，1~2min 后，使用15c刀片做下頜切齒的齦溝內切口，切斷下頜正中系帶與牙面的附著。刀片盡量與牙體長軸平行，避免損傷骨膜組織。再在兩顆切齒遠中做水平附加切口，長度約2mm，如圖 1A。小心剝離頰側黏膜直至暴露頰側牙槽嵴，保證骨膜組織完整，如圖1B。適當剝離舌側黏膜，同樣注意保證骨膜完整。翻瓣完成后，開始微創拔牙。使用刃薄的骨膜分離器置于兩顆切齒之間的牙槽間隔處，近遠中向施力挺松牙齒，如圖 1C。止血鉗加持牙齒后小幅度頰舌向、近遠中向晃動，并向上、向內旋轉施力拔出切齒，如圖1D。此時可見拔牙窩舌側骨壁高聳，頰側骨壁的高度低于舌側約3~5mm。頰側骨壁表面存在天然滋養孔結構，孔內可見紅色血液。使用咬骨鉗少量去除舌側高聳骨壁，使頰舌側骨壁的高度差約為2mm，如圖1E。注射器抽取氯化鈉注射液后沖洗拔牙窩并使用無菌紗布擦干。③植入種植體及骨增量: 于拔牙窩內手動旋入實驗用種植體，至種植體平臺水平高于頰側牙槽嵴頂約2mm，即種植體頰側冠方2mm 處暴露在骨壁之外，舌側完全位于骨壁內，如圖1F~H。實驗組的骨增量操作:首先，使用兩把鑷子分別加持頰側黏骨膜瓣的近遠中冠方邊緣，稍微用力提起黏骨膜瓣可形成口袋狀。將 Bio-Oss 小顆粒骨移植材料用氯化鈉注射液浸濕后覆蓋于種植體頰側，并嚴密充滿頰側黏骨膜瓣所形成的口袋，如圖 1I。再將頰側黏骨膜瓣與舌側瓣拉攏對位縫合。對照組的骨增量操作為: 先根據兩顆切齒頰側骨壁的尺寸和形狀修剪 Bio-Gide 可吸收生物膠原膜，保證長度足夠覆蓋牙槽嵴頂及舌側。使用15c刀片輕輕劃斷頰側黏骨膜瓣偏根方的骨膜組織，避免割斷全層組織，此時可見少量出血，如圖1J。將修剪合適的生物膠原膜插入口袋狀的黏骨膜瓣內側，血液浸透膠原膜根方，使其與黏骨膜瓣的根方貼合，冠方仍保持干燥直立，如圖1K。同樣Bio-Oss小顆粒骨移植材料用氯化鈉注射液浸濕后覆蓋于種植體頰側，并嚴密充滿頰側黏骨膜瓣所形成的口袋，如圖 1L。此時將生物膠原膜向舌側反折，完全覆蓋牙槽嵴頂后插入到舌側黏骨膜瓣內，再使用氯化鈉注射液潤濕，使之貼合，如圖 1M。將頰側黏骨膜瓣與舌側瓣拉攏對位縫合，如圖 1N。④術后取材: 術后連續3d肌內注射抗生素，預防術后感染。進行正常喂養，創口縫線不拆除，任其自行脫落。術后即刻 A、B組各處死一只兔進行下頜前部取材，術后 1個月、3個月、6個月 A、B 組各處死三只取材。(2) Micro CT 掃描測量: 標本進行 Micro CT 掃描，使用CTAn分析軟件測 量: ①種植體頰側骨壁厚度(Buccal bone thickness，BBT) ，分別選取種植體頂端水平(BBT1) 、頂端根方2mm(BBT2) 、頂端根方4mm(BBT3) 及頂端根方6mm(BBT4) 水平測量種植體頰側骨壁厚度; ②種植體頰側骨壁體積(buccal bone volume，BBV) 。(3) 組織學觀察: 標本經脫水包埋后，沿頰舌向縱向切割為200μm切片，依次研磨至20~30μm，然后進行 Leva-Laczko 染色過程，形成最終切片，進行觀察。


4．統計學處理: 應用 SPSS 19.0 統計分析軟件進行數據處理，描述采用中位數(四分位數間距)［Q( P25,P75) 表示，組間比較采用Mann Whitneytest，P＜0.05 為差異具有統計學意義。


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02
結果


所有實驗動物術后一般狀況良好，無死亡，口腔內創口無感染、裂開，無種植體、顆粒狀骨移植材料、生物膠原膜暴露。

1.Micro CT測量結果: 術后即刻數據表明，術中實現了充分的骨增量，A、B 兩組間骨增量無差異。術后1個月時，B組種植體頰側多個水平層面骨壁厚度及整體骨體積均明顯高于A組。術后3個月時B組種植體頰側骨量高于A組，差異具有統計學意義( P＜0.05) 。術后6個月時，兩組種植體頰側最終骨量趨于等量。見表 1~表4。
2.組織學觀察:10倍物鏡采集切片全圖，種植體、頰舌側骨壁及軟組織均完整可見。術后1個月A 組: 種植體頰側附著有新生編織骨結構，內部骨細胞排列不規則，少量成骨細胞可見，如圖 2A、B。B組: 種植體頰側覆蓋大量淋巴細胞，其外表面為原宿主板層骨結構，如圖 2C~ E。術后3個月A組: 種植體頰側新生編織骨組織中骨細胞排列規則程度提高，如圖 3A、B。B組: 種植體頰側附著新生編織骨，骨細胞排列均較為紊亂，如圖 3C、D。術后6個月A、B 兩組均可見種植體頰側粉色成熟板層骨結構，如圖 4A~D。

03
討論


早在1925年，Blaisdell 發表了一篇經典文章，首次將骨膜描述為一個具有兩層結構的組織［13］。現在我們更詳細地知道骨膜是一種薄而堅韌的結締組織，通過 Sharpey 纖維固定在骨面上。通常，我們將骨膜分為淺表的纖維層和深面的生發層。纖維層，顧名思義富含網狀結構的膠原纖維束和成纖維細胞，占骨膜總體積結構比例較大［14］。纖維層為肌腱和韌帶提供附著點，從而還起到了結構支持和穩定作用。生發層位于纖維層內側，與骨外表面接觸。雖然生發層較薄且疏松，但其中含有豐富的血管和細胞。其細胞成分包括未分化的間充質干細胞、骨祖細胞、成骨細胞、破骨細胞，成纖維細胞和血管周細胞［15］。從組織學結構來看，纖維層為骨膜組織提供營養及支持，而生發層是骨膜發揮生理功能的結構，其中未分化的間充質細胞在成骨過程中起到了關鍵作用，它們有助于骨的生長、愈合和修復再生［16］。另外，骨膜血管不僅為骨膜提供營養，還參與骨膜的成骨活動。由于骨膜血管密度高，骨膜內含有豐富的血管周細胞( pericyte) ，即與毛細血管內皮細胞有物理接觸的細胞［17］。血管周細胞具有一定分化潛能，在骨膜成骨的過程中，能夠分化為成骨細胞［18］，作為生發層細胞的補充來源［5,11］。
骨的發生有兩種方式，軟骨內成骨和膜內成骨［19-20］。這種成骨機制的差異主要與不同解剖部位的組織性質有關，長骨的形成依靠軟骨內成骨方式，而顱面骨的形成以及骨的改建過程多依靠骨膜內成骨方式［21］。血供和氧含量在一定程度上也影響著骨膜成骨的方式。當血供、氧氣充足時，間充質干細胞分化為成骨細胞，發生膜內成骨; 血供不足則導致細胞迅速增殖形成軟骨而不是骨［22］。膜內成骨過程還會因骨膜結構被擾亂而誘導形成軟骨。Girgis等［23］在刮除大鼠頂骨骨膜后制造骨折模型，結果發生了軟骨愈合。Uddstromer 等［24］將銳性分離得到的骨膜移植到三種不同的肌肉組織中，全都實現了異位成骨。而將肋骨骨膜生發層剝離“撕下”后再用于修復脛骨缺損，未能發生成骨。這說明利用骨膜成骨時，保證骨膜的完整性至關重要［25］。保證骨膜生發層的完整，間充質細胞才能分化出成骨細胞，繼而形成新骨。
GBR是目前口腔種植臨床中最常用的骨增量術式。GBR的原理是通過屏障膜建立一個隔離的空間，使骨組織在一個無干擾、受保護的條件下發揮其自然愈合能力。然而，人工屏障膜的放置也在一定程度上阻隔了骨膜與植骨區域的血供和細胞交通。另一方面，GBR術中為了實現創口的無張力關閉，需要離斷頰側瓣的骨膜層進行減張，這一操作破壞了骨膜結構的完整性，損傷了骨膜生發層。這些因素都使得骨膜的成骨潛能在 GBR術式中得不到充分利用。
SPAL 技術利用完整的骨膜來容納并覆蓋骨移植材料從而修復種植體頰側骨缺損。該術式與傳統GBR的核心區別在于保證骨膜完整性且不使用人工屏障膜。骨膜表面富含粗大的膠原纖維束，完全可以阻擋纖維組織的過早長入［26］，代替了人工膜的機械屏障作用，為骨組織生長提供充足時間。更關鍵的是，骨膜生發層能夠對骨的修復性再生過程提供血供支持和豐富的細胞成分。骨膜的成骨潛能會因手術創傷而被激活，各種細胞因子、生長因子等可以刺激骨膜衍生細胞的增殖和血管的新生，從而實現成骨［27-28］。在 Trombelli 的臨床研究中15個種植體頰側存在骨缺損的位點，經SPAL 骨增量后愈合3~4個月，80%的位點達到了完全骨充填，且種植體頰側骨壁厚度平均為 3.1 mm; 12個種植體頰側骨壁厚度小于1mm 的位點，術后90%實現了大于 1.5 mm 的臨床臨界值。
本研究為骨膜引導成骨修復種植體頰側骨缺損進行了組織學驗證。首先，該動物模型的建立基本符合實際臨床情況，且兩種術式的各自要點都分別進行了還原。因此，可以說該動物模型的建立是成功的。第二，術后觀察時間節點的設置分別對應骨再生過程所遵循的骨生長和發育的模式。1個月時，編織骨可以成為薄的、分支狀的板層結構，其中的血管網已連接成熟。由前已知，血管形成和充足的血供對于骨的發生和維持都極其重要［29］。因此術后1個月作為一個重要的觀察時間節點，以評價該板層結構的質和量。最初的分支狀編織骨支架可作為板層骨沉積的模板，在術后3~4個月時，轉化為皮質骨和規則松質骨。此時間節點的設置可評價相對成熟的板層骨的質和量。在術后第4個月的時間里，皮質骨將完成哈弗系統的改建，從而完成最終成熟。從第4個月末或第 5 個月初時，隨著皮質骨板的形成，骨再生的塑形過程將重新開始［30］。因此術后6個月時，皮質骨將清晰可辨，骨小梁結構排列更加緊密，以此作為術后的最終觀察時間節點。且臨床中GBR術后的常規愈合周期為6個月，二期手術打開時可見成骨完全。這三個觀察時間節點的設置分別對應骨再生過程所遵循的骨生長和發育的模式。
分析Micro CT測量數據發現在第一個月的愈合期里兩組種植體頰側骨壁厚度及骨體積均大幅度下降，主要與原宿主頰側骨壁的吸收有關。手術創傷會誘導急性炎癥反應，形成大量破骨細胞吞噬頰側束狀骨［31］。然而此時B組種植體頰側多個水平層面骨壁厚度及整體骨體積均明顯高于A組。結合同時期組織切片結果，在B組中種植體頰側硬組織主要為原宿主骨壁，而A組均為紫色新骨。可以說明術后早期階段骨膜對原宿主骨壁的保護減少了骨吸收。B組骨膜瓣充足的血運可快速重建頰側骨壁的血液循環，維持原宿主骨壁中骨細胞的活性。充足的血供在一定程度上還能夠提高局部骨組織的抗感染能力，避免存活的骨細胞被吸收［32］。相比于A組中生物膠原膜對血供的隔離,B組在一定程度上實現了對原宿主骨量的維持。在修復性骨再生方面，骨膜直接接觸骨增量區域是具有更好的誘導成骨效果的。第一，覆蓋在成骨區表面的骨膜表層纖維層中粗大的纖維束交織成網［3］，成功地隔離了頰側軟組織的優先長入，為成骨細胞的進入爭取了時間和空間。并且纖維層作為根方肌腱的附著點起到了結構支持和穩定作用，為成骨區域提供了無干擾、受保護的環境。第二，骨膜深層的生發層直接覆蓋成骨區域，為成骨區域提供了豐富的間充質干細胞和血管周細胞，這些細胞能夠在細胞因子和生長因子的刺激下分化成為骨祖細胞。與此同時，骨膜內側豐富的血管成分為成骨區域帶去了充足的氧氣、血供和各種生物因子。在合適的條件下，膜內成骨程序啟動［17,20］，骨祖細胞快速直接分化為成骨細胞，從而能夠實現成骨細胞的大量生成并發揮生理功能分泌類骨質。而生物膠原膜在阻隔軟組織長入的同時，在一定程度上也阻礙了骨膜生發層中天然的血管源性細胞和骨源性細胞的進入，不利于成骨細胞的形成。
術后3個月時雖然在各個水平層面上兩組種植體頰側骨壁厚度并無差異，但總的骨壁體積B組仍高于A組，說明B組中骨膜維持骨增量空間的能力要強于生物屏障膜。GBR的原理核心在于要建立一個隔離的空間，使骨組織在一個無干擾、受保護的條件下發揮其自然愈合能力。我們知道，骨膜堅韌的纖維層為肌腱和韌帶提供附著點，從而能夠起到結構支持和穩定作用。且當骨膜受到應力作用時，其纖維彈性組織受牽拉會離開或靠近生發層［33］，這種位移改變會影響成骨細胞的生理活性，在細胞水平上引起動態微環境的改變。合適的應力能夠提高骨膜組織中骨源性和血管源性生長因子的表達，使間充質干細胞向成骨細胞發展，在早期階段加強成骨細胞分化作用［34］。Schmidt 等［35］在兔下頜骨骨膜下安置牽張裝置將骨膜牽開，一段時間后組織學觀察發現有大量成骨細胞、膠原纖維生成，并有較多骨基質沉積，骨膜牽張成骨首次得到了組織學上的證明。
術后6個月時，兩組種植體頰側最終骨量趨于等量。這說明愈合后期A組也可以生成與B組等量的編織骨支架結構。骨膜在編織骨向成熟的皮質骨和規則的松質骨結構轉化的過程中并未顯示出特別的優勢。術后3個月時，B組呈現出較為活躍的骨再生狀態，新生編織骨成熟度較低，而此時A組基本完成了編織骨形成，已經開始向成熟板層骨轉化。即B組成骨進程晚于A組，這可能與早期階段復雜的應激反應程序有關。B組術后1個月時種植體表面出現大量淋巴細胞浸潤，首先可以排除感染因素，其次，由于后期B組發生了種植體骨結合及頰側骨再生，所以不排除術后1個月時的炎癥反應屬于積極現象，淋巴細胞的大量生成或許是自噬機制被激活后促進炎癥過程的表現［36-38］。真核細胞在應激狀態下會啟動自噬機制，改變細胞的功能及代謝［39］。研究表明，自噬過程可以促進成骨細胞的分化，維持骨細胞的生存。還可以降低破骨細胞數量，抑制破骨細胞分化，并且能減弱其骨吸收作用［40］。以上這些作用對于新骨生成和原宿主頰側骨壁的保留都具有積極作用，但要確定B組中炎癥反應是否與自噬相關還需要進一步的細胞學、分子生物學的研究。術后6個月的組織切片結果表明A組和B組最終均實現了種植體骨結合和頰側骨再生。在愈合后期主要完成的是哈弗系統的改建和骨再生的塑形過程，最終兩組形成的成熟新骨骨量是相同的。這與目前臨床已完成的病例結果相吻合。
應用 SPAL 技術的愈合期間無纖維組織長入成骨區，術后6個月可實現種植體骨結合及頰側骨再生，效果與放置屏障膜的GBR技術無顯著差異。且骨膜替代人工屏障膜有利于維持原始骨壁，且具有更好的空間維持作用。


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